Multiphoton

Décrite pour la première fois par Maria Goeppert-Mayer en 1931, l'absorption à deux photons est le concept selon lequel deux photons de fréquences identiques ou différentes peuvent exciter une molécule d'un état d'énergie (généralement l'état fondamental) à un état d'énergie supérieur en un seul événement quantique.

Pour que cela se produise, les deux photons doivent frapper la molécule à moins d'une femtoseconde l'un de l'autre (10-15 secondes). Cela nécessite un laser focalisé capable de produire des impulsions lumineuses très rapides (~80 MHz) avec une grande puissance (~150 000 W de puissance de crête).

La longueur d'onde de la lumière est proportionnelle à son niveau d'énergie. Plus la longueur d'onde est courte, plus elle a d'énergie. Il s'agit d'une relation linéaire, de sorte qu'un photon d'une longueur d'onde de 400 nm possède deux fois plus d'énergie qu'un photon d'une longueur d'onde de 800 nm. La microscopie à fluorescence traditionnelle utilise un seul photon pour exciter les sondes fluorescents en utilisant des longueurs d'onde d'excitation principalement visibles (390-700 nm). Après l'excitation, l'électron redescend à son état stable et, au cours de ce processus, il libère un photon de lumière dont l'énergie est légèrement inférieure à celle du photon d'excitation (perdue en raison de processus tels que la relaxation vibratoire).

En microscopie à deux photons, deux photons de lumière d'une longueur d'onde double sont utilisés pour exciter les sondes fluorescents. Toutefois, un seul photon est libéré lorsque l'électron descend dans son orbite la plus stable. Ce photon aura la même longueur d'onde que la méthode équivalente de fluorescence à un photon (c'est-à-dire environ la moitié de la longueur d'onde d'excitation). Les longueurs d'onde utilisées pour exciter ces mêmes colorants avec deux photons ont donc tendance à se situer entre 800 et 1000 nm environ, dans le spectre infrarouge.

L'un des principaux avantages de la microscopie à deux photons est sa capacité à limiter l'excitation à un minuscule volume focal dans les échantillons épais. Le point focal de l'objectif est le seul espace présentant une densité de photons suffisamment élevée pour garantir la présentation simultanée de deux photons au fluorophore. Cela signifie qu'il n'y a pas de lumière d'émission hors foyer et que toute lumière à la longueur d'onde d'émission doit provenir de ce point unique. En microscopie à fluorescence "1-photon" le laser excite la sonde fluorescente dans tout l'échantillon ou à travers un cône de lumière jusqu'au plan focal (par exemple, en microscopie confocale) Cela conduit à une excitation plus importante hors foyer, entraînant un photoblanchiment plus rapide et une phototoxicité importante (l'effet toxique des fluorophores activés sur les cellules).

L'utilisation de longueurs d'onde infrarouges présente un avantage supplémentaire. La lumière du spectre visible se disperse beaucoup dans les tissus biologiques, ce qui limite considérablement la profondeur à laquelle elle peut pénétrer avec suffisamment de puissance pour exciter un fluorophore. Les lasers infrarouges utilisés pour la microscopie à deux photons diffusent beaucoup moins. Cela signifie que la lumière du laser infrarouge a suffisamment de puissance pour exciter les fluorophores jusqu'à environ 1 mm dans les tissus vivants. En comparaison, la microscopie confocale à photon unique ne peut pénétrer que jusqu'à environ 200 µm.

La visualisation de certaines structures (collagen, fibres, muscles, élastine, laminine...) est également possible sans marquage en seconde harmonique (SHG) et troisième harmonique (THG).

Applications proposées :

• imagerie haute résolution sur tissus-épais (zebrafish, drosophile, explants, tissus transparisés, organoïdes…)
• imagerie multi modalité (couplage imagerie corps entier et imagerie de l’organe à haute résolution,…)
• imagerie haute résolution in vivo sur chambres optiques de souris