Multifotón

Descrita por primera vez por Maria Goeppert-Mayer en 1931, la absorción de dos fotones es el concepto de que dos fotones de la misma o diferente frecuencia pueden excitar una molécula desde un estado energético (normalmente el estado básico) a un estado energético superior en un único evento cuántico.

Para que esto ocurra, los dos fotones deben incidir en la molécula con una diferencia de un femtosegundo (10-15 segundos). Esto requiere un láser enfocado capaz de producir pulsos de luz muy rápidos (~80 MHz) con alta potencia (~150.000 W de potencia máxima).

La longitud de onda de la luz es proporcional a su nivel de energía. Cuanto más corta es la longitud de onda, más energía tiene. Se trata de una relación lineal, de modo que un fotón con una longitud de onda de 400 nm tiene el doble de energía que un fotón con una longitud de onda de 800 nm. La microscopía de fluorescencia tradicional utiliza un solo fotón para excitar las sondas fluorescentes utilizando principalmente longitudes de onda de excitación visibles (390-700 nm). Tras la excitación, el electrón vuelve a su estado estacionario y, en el proceso, libera un fotón de luz cuya energía es ligeramente inferior a la del fotón de excitación (perdida debido a procesos como la relajación vibracional).

En la microscopía de dos fotones, se utilizan dos fotones de luz de doble longitud de onda para excitar las sondas fluorescentes. Sin embargo, sólo se libera un fotón cuando el electrón desciende a su órbita más estable. Este fotón tendrá la misma longitud de onda que el método equivalente de fluorescencia de un fotón (es decir, aproximadamente la mitad de la longitud de onda de excitación). Por lo tanto, las longitudes de onda utilizadas para excitar estos mismos colorantes con dos fotones suelen estar en torno a los 800-1000 nm en el espectro infrarrojo.

Una de las principales ventajas de la microscopía de dos fotones es su capacidad para limitar la excitación a un volumen focal minúsculo en muestras gruesas. El punto focal del objetivo es el único espacio con una densidad de fotones lo suficientemente alta como para garantizar que se presenten dos fotones al fluoróforo simultáneamente. Esto significa que no hay luz de emisión fuera de foco y que toda la luz en la longitud de onda de emisión debe originarse en este único punto. En la microscopía de fluorescencia de "1 fotón", el láser excita la sonda fluorescente en toda la muestra o a través de un cono de luz hasta el plano focal (por ejemplo, en la microscopía confocal), lo que conlleva una mayor excitación fuera de foco, lo que provoca un fotoblanqueo más rápido y una elevada fototoxicidad (el efecto tóxico de los fluoróforos activados en las células).

El uso de longitudes de onda infrarrojas tiene una ventaja adicional. La luz en el espectro visible se dispersa mucho en el tejido biológico, lo que limita mucho la profundidad a la que puede penetrar con suficiente potencia para excitar un fluoróforo. Los láseres infrarrojos utilizados para la microscopía de dos fotones dispersan mucho menos. Esto significa que la luz láser infrarroja tiene suficiente potencia para excitar los fluoróforos hasta aproximadamente 1 mm en el tejido vivo. En comparación, la microscopía confocal monofotónica sólo puede penetrar hasta unos 200 µm.

La visualización de ciertas estructuras (colágeno, fibras, músculos, elastina, laminina...) también es posible sin el etiquetado de segundo armónico (SHG) y tercer armónico (THG).

Aplicaciones propuestas :

• imágenes de alta resolución en tejidos gruesos (pez cebra, drosophila, explantes, transparencias, organoides...)
• imágenes multimodales (acoplamiento de imágenes de cuerpo entero y de órganos de alta resolución, etc.)
• imágenes in vivo de alta resolución en cámaras ópticas de ratón