Microscopía confocal y disco giratorio

En la microscopía de epifluorescencia convencional, uno de los principales problemas es la presencia de un importante ruido de fondo relacionado con el grosor del objeto observado. Aunque el foco está en un plano focal preciso, el registro de la información se ve empañado por el ruido de fondo que se superpone a la imagen del plano observado: este ruido resulta de la excitación, por parte de la fuente de luz, de todos los fluorocromos situados en el trayecto de la luz.

El microscopio confocal actúa como un micrótomo óptico, su principio consiste en enfocar, a través de un objetivo, un rayo láser que excitará los fluorocromos en un punto de la muestra, para luego recuperar, en un fotomultiplicador, la señal luminosa emitida en este punto.

Se coloca un agujero de alfiler delante del fotomultiplicador para detener cualquier señal que no provenga del plano focal. La señal recibida se amplifica en el fotomultiplicador, se procesa para mejorar la relación señal/ruido y se digitaliza. La imagen se construye punto por punto escaneando (X,Y) el campo analizado con la ayuda de espejos de desviación de la fuente de luz. Una platina motorizada desplaza la preparación a lo largo del eje Z, permitiendo la captura de diferentes planos ópticos en el espesor del objeto. Las imágenes resultantes se almacenan en la memoria de un ordenador.

El uso del módulo de mejora de la resolución Airyscan introduce un nuevo concepto de detector para la microscopía de escaneo láser confocal (LSM). Mientras que los diseños tradicionales de LSM utilizan una combinación de detector estenopeico y punto a punto, el airyscan es un detector de área de tubo fotomultiplicador de arseniuro de galio (GaAsP-PMT) de 32 canales que recoge una imagen seccionada ópticamente en cada posición de exploración. Cada elemento del detector funciona como un agujero de alfiler de menor apertura (0,2 UA). El conocimiento de la trayectoria del haz y de la distribución espacial de cada canal del detector permite obtener imágenes de gran eficiencia lumínica con una mejor resolución y relación señal-ruido.

El microscopio confocal Spinning-Disk permite obtener una imagen con una resolución axial cercana a la obtenida con un confocal de barrido láser. Además, permite adquisiciones muy rápidas y limita el fotoblanqueo y la fototoxicidad para las observaciones a largo plazo.

La fuente de iluminación utilizada suele ser un láser. La trayectoria de la luz de excitación pasa por una parte del disco estenopeico que dividirá la iluminación de la muestra en varios cientos de puntos.

Se utiliza un disco de microlente para enfocar la luz en los agujeros de los alfileres y así reducir las pérdidas de luz. Cuando el disco gira (de 1500 rpm a 5000 rpm según la versión). La fluorescencia reemitida por la muestra es recogida por el objetivo antes de pasar por los agujeros de los alfileres. Los agujeros de alfiler sólo dejan pasar los rayos de fluorescencia perpendiculares al disco y procedentes del plano focal del objetivo, que se envían a la cámara. La alta velocidad de rotación del disco y la excitación a un nivel de luz relativamente bajo permiten adquisiciones muy rápidas y limitan considerablemente el fotoblanqueo y la fototoxicidad.

El módulo Live-SR, combinado con la rotación del disco, mejora la relación señal-ruido de la imagen y mejora la resolución en un factor de 2 (105 nm con el objetivo 100xSR), manteniendo la velocidad de adquisición del disco giratorio, hasta 1000 fotogramas por segundo. Es una solución muy adecuada para la obtención de imágenes celulares de alta resolución de muestras débilmente marcadas y/o sensibles al fotoblanqueo. La técnica se basa en una técnica de iluminación estructurada, demodulada ópticamente con procesamiento de deconvolución.